Metabolismus cytokininů zeatinového typu u jednoděložných rostlin
HLUSKA, Tomáš; GALUSZKA, Petr
2017 - English Cytokininy jsou rostlinné hormony, deriváty adeninu s postranním řetězcem v N6 poloze. Ovlivňují mnoho fyziologických procesů. Zatímco metabolismus trans zeatinu a isopentenyladeninu, které jsou považovány za vysoce aktivní cytokininy, byl extenzivně studován, metabolismus dalších, jako cis zeatin, dihydrozeatin, či aromatické cytokininy je opomíjen. V této práci jsme použili jako model pro studium metabolických přeměn cytokininů, hlavně zeatinů, vyvíjející se kukuřičné zrno. Místo zeatin reduktasy jsme však zjistili novou enzymatickou aktivitu přeměňující trans zeatin na 6 (3 methylpyrrol 1 yl)purin. Enzym se však nepodařilo identifikovat kvůli jeho nestabilitě. Zato se nám podařilo identifikovat enzym odpovědný za cis trans isomeraci zeatinů jako nukleotidpyrofosfatasu/fosfodiesterasu. Potvrdili jsme jeho aktivitu; za substráty preferuje FAD a jiné dinukleotidy. Navrhli jsme několik jeho funkcí in planta. Dále jsme navrhli dvě nové hypotézy týkající se metabolismu a fyziologie cytokininů. První vysvětluje převahu údajně neaktivního cis zeatinu v některých rostlinách. Druhá navrhuje dvourychlostní cytokininový systém. Cytokinins are plant hormones, derivatives of adenine with side chain at the N6 position. They are involved in many physiological processes. While the metabolism of trans zeatin and isopentenyladenine, that are considered to be highly active cytokinins, was extensively studied, the metabolism of minor cytokinins as cis zeatin, dihydrozeatin and aromatic cytokinins is largely neglected. Here we used maize developing seed as model to study interconversions of cytokinins, mainly zeatins. Instead of zeatin reductase, we have detected novel enzymatic activity converting trans zeatin to 6 (3 methylpyrrol 1 yl)purine. The enzyme was not identified due to its instability. On the other hand, we have identified the causative enzyme of zeatin cis trans isomerization as nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase. Activity of the enzyme was confirmed; it prefers FAD and other dinucleotides as substrates. We proposed several functions for the enzyme in planta. Further, two novel hypotheses concerning cytokinin metabolism and physiology are presented. The first explains prevalence of cis zeatin, a purportedly inactive cytokinin, in certain species. The second one proposes a two speed cytokinin system. Keywords: anticytokininy; cis zeatin; cytokininy; enzymologie; flaviny; isomerace; kukuřice; metabolismus; nukleotidpyro-fosfatasa/fosfodiesterasa; semena; vývoj semene; zeatin cistrans isomerasa; zeatiny; Anticytokinins; cis-Zeatin; Cytokinins; Flavins; Isomerization; Kernels; Maize; Metabolism; Nucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase; Seed Development; Zeatin cis trans Isomerase; Zeatins Available in digital repository of UPOL. Metabolismus cytokininů zeatinového typu u jednoděložných rostlin

Cytokininy jsou rostlinné hormony, deriváty adeninu s postranním řetězcem v N6 poloze. Ovlivňují mnoho fyziologických procesů. Zatímco metabolismus trans zeatinu a isopentenyladeninu, které jsou ...

HLUSKA, Tomáš; GALUSZKA, Petr
Univerzita Palackého v Olomouci, 2017

Interpersonální dimenze v novinové zprávě
MOLNÁR, Ondřej; TÁRNYIKOVÁ, Jarmila
2017 - English Předložená disertační práce se věnuje interpersonální dimenzi v novinové zprávě z pohledu žánrové analýzy. Interpersonální metafunkce je součástí každé lidské komunikace a může být studována z mnoha hledisek. Záběr předložené disertační práce byl vymezen následujícími oblastmi zájmu, které byly rozpracovány v jednotlivých kapitolách práce: 4. rétorika zpravodajských hodnot (news values) jak v psaném textu, tak v obrazovém vyjádření (tedy ve fotografiích novinové zprávy); 5. rétorika a významy obrazového materiálu v novinové zprávě; 6. rétorika titulků a novinové zprávy z pohledu textové struktury a jejich potenciál interaktivnosti. První kapitola disertační práce představuje metodologický rámec výzkumu. Druhá kapitola se zabývá problematikou zpravodajských hodnot, které jsou autorem práce chápány jako hodnoty, které jednotlivé proběhnuvší události posouvají do oblasti zpravodajství. Z tohoto pohledu zpravodajské hodnoty jsou interpersonálně laděné, protože si kladou za cíl přitáhnout pozornost čtenáře ke konkrétní novinové zprávě. Třetí kapitola představuje metafunkční přístup k analýze obrazového materiálu (fotografií) v novinové zprávě, přičemž si klade za cíl přispět k hlubšímu pochopení procesů a významů ve fotografiích tohoto žánru (optikou reprezentačních [representational], interakčních [interactional] a kompozičních [compositional] významů). Vedle analýzy kompozice dle Kressa a van Leeuwena (2006), kterou autor práce hodnotí jako zastaralou a nefunkční, jsou navíc všechny fotografie analyzovány perspektivou tzv. systému rovnováhy (the Balance network; Caple [2013]), která analyzuje obrazový material i z pohledu obrazové rovnováhy (symetrie, asymetrie, etc.). Kapitola čtvrtá se zabývá časovou deixí a její úlohou v novinové zprávě. Klade si za cíl ukázat, jakým způsobem je časovost "kódována" v novinové zprávě a do jaké míry jsou posuny v kategorii času (přítomný prostý čas v nadpise zprávy [headline], předpřítomný čas v první větě zprávy [lead] a minulý prostý v těle zprávy [body copy]) pragmaticky motivovány snahou sdílet časový kontext se čtenáři. The present dissertation deals with the interpersonal dimension in the hard news story genre. However, There is no doubt the interpersonal metafunction pervades all human communication and can be studied from different perspectives. Thus, the following areas of interest delimit the scope of the present research project. They include: 1. The rhetoric of newsworthiness both in the verbal and visual modality. 2. The rhetorical organization and meaning-making of news images. 3. The rhetoric of headlines as well as the textual rhetoric of news texts as interactive devices. While Chapter one offers the methodological framework and concepts of the present study, Chapter two deals with the rhetoric of newsworthiness. The notion of newsworthiness is understood here as the ability of news values to make an event worthy of being news. As such it represents an interpersonally-oriented phenomenon, the aim of which is to draw the readers' attention. Chapter three presents a metafunctional approach to the analysis of news images in the hard news story genre. Its primary aim is to contribute to a better understanding of meaning-making processes of news storytelling (viewed simultaneously through representational, interactional and compositional meanings). In addition to that, all images in the data set are analysed for their compositional configurations following the Balance network, which takes into account the balance of each news image. Chapter four deals with the pragmatic category of deixis as one of the many above mentioned aspects of communication. The aim of the chapter is to show how temporality is encoded in news stories and how shifts of grammatical tense are pragmatically motivated by the need to negotiate a shared temporal context with the readers. Keywords: zpravodajské hodnoty; mediální diskurs; žánr novinové zprávy; žánrová analýza; multimodalita; pragmatika; časová deixe.; news values; media discourse; hard news story genre; genre analysis; multimodality; pragmatics; temporal deixis. Available in digital repository of UPOL. Interpersonální dimenze v novinové zprávě

Předložená disertační práce se věnuje interpersonální dimenzi v novinové zprávě z pohledu žánrové analýzy. Interpersonální metafunkce je součástí každé lidské komunikace a může být studována z mnoha ...

MOLNÁR, Ondřej; TÁRNYIKOVÁ, Jarmila
Univerzita Palackého v Olomouci, 2017

Matematické modelování fotosyntetických procesů
LYU, Hui; LAZÁR, Dušan
2017 - English Available in digital repository of UPOL. Matematické modelování fotosyntetických procesů

LYU, Hui; LAZÁR, Dušan
Univerzita Palackého v Olomouci, 2017

Sodno-draselná ATPasa - exprese, purifikace a její interakce s malýi molekulami
ŠEFLOVÁ, Jaroslava; KUBALA, Martin; KUBALA, Martin
2017 - English Dizertační práce se zaměřuje na studium významného membránového proteinu, sodno-draselné pumpy. Tento enzym svou funkcí vytváří elektrochemický gradient, který je významný pro celou řadu buněčných procesů. V případě nesprávné funkce sodno-draselné ATPasy dochází ke vzniku patologických stavů, poruch a nemocí. Cílem této práce bylo studovat souvislosti mezi strukturou a funkcí toho proteinu s využitím dostupných experimentálních postupů. Příprava celé sodno-draselné pumpy byla provedena dvěma metodami - přímou izolací z tkáně a heterologní expresí v kvasinkách. Enzym izolovaný z prasečích ledvin byl použit pro zkoumání inhibice sodno-draselné pumpy po interakci s flavonolignany, halogenovanými chinolony a platinovými cytostatiky. Změna aktivity enzymu byla detekována pomocí modifikované Baginského metody, která určuje koncentraci fosfátu z hydrolýzy ATP. Dále byly heterologní expresí v bakteriích připraveny izolované cytoplasmatické segmenty proteinu (C45 a C23 kličky). Tyto kličky umožňují zkoumat interakci sodno-draselné pumpy a biologicky významných látek rozpustných ve vodných pufrech. Vybrané aktivní látky byly cílem dalšího výzkumu zaměřeného na odhalení vazebného místa a mechanismu inhibice enzymu. The Na+/K+-ATPase (NKA) is an essential membrane protein establishing electrochemical gradient used in cell processes. Dysfunction of NKA leads to pathological states and diseases. This thesis is focused on the relations between structure and function using available experimental approaches. Whole protein was prepared by two methods - direct isolation from porcine kidney and by heterologous expression in yeast. NKA isolated from porcine kidney was used for testing of biologically active molecules such as potential drugs (flavonolignans, halogenated hydroquinolones and platinum-based complexes). Furthermore, we studied the interactions of promising molecules inhibiting NKA activity using the modified Baginsky assay. Isolated cytoplasmic parts of the enzyme, represented by C23 and C45 loops, were used for determination of their binding site and for study of inhibitory mechanism. Keywords: sodno-draselná ATPasa; exprese v bakteriích; exprese v kvasinkách; C45 klička; C23 klička; Baginského metoda určení ATPasové aktivity; flavonolignany; halogenované chinolony; cisplatina; sodium-potassium ATPase; heterologous expression in bacteria; heterologous expression in yeast; C45 loop; C23 loop; Baginsky assay; flavonolignans; halogenated quinolones; cisplatin Available in digital repository of UPOL. Sodno-draselná ATPasa - exprese, purifikace a její interakce s malýi molekulami

Dizertační práce se zaměřuje na studium významného membránového proteinu, sodno-draselné pumpy. Tento enzym svou funkcí vytváří elektrochemický gradient, který je významný pro celou řadu buněčných ...

ŠEFLOVÁ, Jaroslava; KUBALA, Martin; KUBALA, Martin
Univerzita Palackého v Olomouci, 2017

Solid waste management in Egypt
ELFEKI, Mohamed; TKADLEC, Emil
2017 - English Available in digital repository of UPOL. Solid waste management in Egypt

ELFEKI, Mohamed; TKADLEC, Emil
Univerzita Palackého v Olomouci, 2017

Mapping and identification of flowering time genes in bread wheat (Triticum aestivum L.)
IVANIČOVÁ, Zuzana; ŠAFÁŘ, Jan; ŠAFÁŘ, Jan
2017 - English Pšenica letná (Triticum aestivum) je základnou plodinou pre 30 % celosvetovej populácie. V súčasnej dobe je nutné jej ročný výnos zvyšovať, a to v dôsledku neustáleho rastu počtu ľudí. Vyšší výnos je však ohrozený rôznymi abiotickými a biotickými faktormi. Jedným z možných spôsobov je modifikácia času kvitnutia tak, aby bol prispôsobený lokálnym podmienkam prostredia. Optimálny čas kvitnutia je totiž dôležitý pre ochranu kvetných častí pred poškodením (v dôsledku chladu alebo sucha), a teda zabezpečenie vhodných podmienok pre vývin obiliek. Hlavným cieľom predloženej práce je identifikácia génov/alel, ktoré sú zodpovedné za variáciu v čase kvitnutia. Vlastnú prácu je možné tematicky rozdeliť na dve časti. Prvá časť sa zaoberá identifikáciou novej alely vernalizačného génu Vrn-A1f-like. Táto alela je charakteristická sekvenčnými zmenami v promótorovej oblasti (krátke delécie) a v oblasti prvého intrónu (inzercia miniature inverted transposable element a rozsiahla delécia). Alela Vrn-A1f-like bola zodpovedná za oneskorenie kvitnutia v porovnaní s už predtým identifikovanou alelou Vrn-A1a. Zodpovednosť vyššieho počtu kópií fotoperiodického génu Ppd-B1 za rozdiel v čase kvitnutia u variet pšenice letnej bola nosnou témou druhej časti práce. V štúdii bola zároveň identifikovaná variabilita v čase kvitnutia v rámci línií s troma kópiami tohto génu. V snahe zistiť príčinu týchto rozdielností došlo k analýze expresného profilu a rovnako aj metylácie sledovaného génu. Práve identifikácia nových génov/alel zodpovedných za rozdiely v kvitnutí, ich charakterizácia a identifikácia funkcie v rámci biochemických dráh umožní úplné pochopenie tohto dôležitého procesu. Posledná časť práce sa zaoberala identifikáciou miesta domestikácie a evolučných vzťahov medzi skupinou tetraploidných pšeníc. Práve charakterizácia týchto druhov na úrovni genómu určenie vzťahov medzi nimi môže viesť k identifikácii nového, cenného zdroja genetickej variability. Implementácia týchto znalostí do procesu šľachtenia zas umožní tvorbu nových kultivarov schopných vo výraznej miere odolávať nepriaznivým podmienkam prostredia. Bread wheat (Triticum aestivum) is one of the most important crops. It is a staple food for 30% of population. Increasing of human population leads to necessity to achieve higher yield without enlarging of arable land. One way of achievement may rest in adaptation of flowering process to microenvironmental conditions. The flowering and subsequent grain filling period is sensitive and optimal conditions during this process have profound impact on grain quality and yield. This work focuses on identification of genes and their allelic variation which participates on adjustment of flowering. This work can be divided into two parts. The first part of the work deals with identification and characterization of new allele of vernalization gene VRN-A1 VRN-A1f-like allele. The very original source of this allele is tetraploid wheat Triticum millitinae Zhuk. with AAGG genomic composition. The allele confers spring habit and is characteristic by short deletions in promoter region, insertion of miniature inverted transposable element and wide deletion in the first intron. This allele was responsible for delayed flowering in comparison to previously identified Vrn-A1a allele. The second project determined that higher number of copies of photoperiodic gene Ppd-B1 was responsible for difference in flowering time between two bread wheat varieties. Identification of flowering time variability in F7 generation lines with three copies of Ppd-B1 led to determination of expression and methylation pattern of chosen lines, in order to reveal nature of this intragroup variation. The important source of new genes and alleles are domesticated tetraploid wheat. The identification of evolutionary relationship within these groups and their genetic characterization can lead to discovery of new sources of variability. The additional part of the work is dealing with evolutionary relationship within tetraploid wheats and their domestication. Knowledge of flowering time genes, their functions and interaction in determination of this process is important prerequisite for breeding new varieties adapted to local microenvironment. Keywords: pšenica letná; čas kvitnutia; genetické mapovanie; analýza QTL; vernalizácia; fotoperióda; bread wheat; flowering time; genetic mapping; QTL analysis; vernalization; photoperiod Available in digital repository of UPOL. Mapping and identification of flowering time genes in bread wheat (Triticum aestivum L.)

Pšenica letná (Triticum aestivum) je základnou plodinou pre 30 % celosvetovej populácie. V súčasnej dobe je nutné jej ročný výnos zvyšovať, a to v dôsledku neustáleho rastu počtu ľudí. Vyšší výnos ...

IVANIČOVÁ, Zuzana; ŠAFÁŘ, Jan; ŠAFÁŘ, Jan
Univerzita Palackého v Olomouci, 2017

Kvantově optické experimenty zaměřené na kvantové zpracování informace
MIKOVÁ, Martina; DUŠEK, Miloslav; DUŠEK, Miloslav
2017 - English Disertační práce je založena na pěti originálních publikacích a shrnuje hlavní experimentální výsledky. První realizovaný experiment testoval využití elektro-optické dopředné vazby pro zvýšení pravděpodobnosti úspěchu lineárně optických hradel. Experimentální výsledky ukázaly, že dopředná vazba zdvojnásobila pravděpodobnost úspěchu lineárně-optického programovatelného kvantového fázového hradla aniž by ovlivnila kvalitu dosažených výsledků. Koncept zavedení podmíněné operace pomocí dopředné vazby byl úspěšně aplikován i v dalších realizovaných experimentech. Následující experimenty se zabývaly přenosem kvantového stavu a rozlišovacími strategiemi. Bylo sestrojeno experimentální zařízení pro bezchybné rozlišení dvou optických paměťových záznamů reprezentovaných dvěma děliči svazku s navzájem různými odrazivostmi. Realizované zařízení využívalo nejmenší možné energie, v průběhu měření byl paměťový záznam vystaven v průměru pouze zlomku energie jednoho fotonu. Následným projektem byla experimentální realizace optimálního rozlišení dvou známých projektivních kvantových měření pomocí kvantově provázaného stavu. Výsledná experimentální data jasně demonstrovala výhodu rozlišovací strategie využívající dvě kvantově provázané částice v porovnání se strategií využívající pouze jeden kvantový bit. Dále byl realizován experiment pro přenos stavu kvantového bitu. Experiment byl využit k ověření nově navržené, přímo měřitelné míry efektivní nerozlišitelnosti částic, která určuje reálnou hranici kvality přenosu kvantového stavu. Zároveň jsme tuto míru porovnali s běžně užívaným překryvem stavů, i když překryv stavů lze použít pouze tehdy, jsou-li tyto částice ve faktorizovaném stavu. Výsledky experimentu potvrdily, že částice mohou sloužit pro přenos kvantové informace, i když jsou jejich další stupně volnosti provázané. Posledním realizovaným experimentem byl přenos neznámého kvantového stavu mezi dvěma vzájemně slabě interagujícími částicemi. Přenosu kvantového stavu bylo dosaženo vhodným měřením fotonu, který nesl neznámý kvantový stav, v kombinaci s aplikací filtrace na stav cílového fotonu. Optimální filtrace závisí na vzájemné interakci částic, na výsledku měření a na původním stavu částice, na niž je neznámý stav přenášen. This Thesis is based on five original publications and concludes main experimental results. Firstly, we experimentally verify the possibility of increasing success probability of linear optical quantum gates utilizing an electro-optical feed-forward loop. We find out that the loop doubles the success probability of linear-optical programmable quantum phase gate. Moreover, any gate parameters like a fidelity, purity etc. are not influenced. The concept of a conditionally applied operation via the feed-forward loop is successfully implemented into other experiments. Further publications deal with quantum state transfer and discrimination tasks. We experimentally implement a device for perfect discrimination of two optical memory records which are represented by two beam splitters with different splitting ratios. For discrimination, this device utilizes in average less than fraction of a single photon energy. Further, we experimentally implement the device for optimal discrimination of two known projective single-qubit quantum measurements. The experimental results clearly confirm the advantage of the proposed more demanding entanglement-assisted discrimination scheme compared to a single-qubit probe scheme. A quantum state transfer is experimentally realized to examine particle properties. A new measure of particles' effective indistinguishability directly determines the fidelity of the transferred state. We compare it with commonly used overlap of quantum states of particles, which is defined only for factorable states. The experimental results confirm that even if some noninformational degrees of freedom of two particles are entangled, the particles can still serve as good carriers of qubits. Finally, we experimentally realize a faithful unidirectional qubit state transfer between two weakly interacting photonic qubits. The qubit state transfer is achieved by a combination of a suitable measurement on the unknown qubit and a quantum filtering on the target qubit. The filtering depends on the initial target-qubit state and on the outcome of the measurement applied on the unknown qubit. Keywords: Experimentální kvantová optika; lineární optika; vláknová optika; kvantové zpracování informace; elektro-optická dopředná vazba; integrovaný elektro-optický fázový modulátor; fotony; Machův-Zehnderův interferometr; sekvenční aktivní fázová stabilizace.; Quantum optics experiments; linear optics; fibre optics; quantum information processing; electro-optical feed-forward loop; integrated electro-optical phase modulator; photons; Mach-Zehnder interferometer; sequential active phase stabilization. Available in digital repository of UPOL. Kvantově optické experimenty zaměřené na kvantové zpracování informace

Disertační práce je založena na pěti originálních publikacích a shrnuje hlavní experimentální výsledky. První realizovaný experiment testoval využití elektro-optické dopředné vazby pro zvýšení ...

MIKOVÁ, Martina; DUŠEK, Miloslav; DUŠEK, Miloslav
Univerzita Palackého v Olomouci, 2017

Studium nových systémů pro nekatalyzované konjugační reakce s azidy
JEDINÁKOVÁ, Petra; HLAVÁČ, Jan; HLAVÁČ, Jan
2017 - English Nekatalyzované konjugační reakce alkynů s azidy jsou široce používané v řadě biologických aplikací. Ačkoliv byla vyvinuta řada derivátů cyklických alkynů pro tyto účely, jejich komplikovaná a multi-kroková příprava, často spojená s nízkými výtěžky, je limitací pro jejich rozsáhlejší využití. Dalším problémem je také často nedostatečná charakterizace produktů vznikajících samotnou konjugační reakcí těchto alkynů s azidy. Disertační práce byla zaměřena na přípravu dvou typů sloučenin pro nekatalyzované konjugační reakce s azidy. Prvním typem byly deriváty již známého aza-dibenzocyclooctynu u kterého byly nejprve studovány konjugační reakce s azidy odvozenými od 5-methyluridinu. Vzniklé produkty byly charakterizovány pomocí detailní NMR studie, která vedla ke zjištění přítomnosti konformačních izomerů u všech připravených sloučenin. Příčina vzniku těchto izomerů a jejich struktury byly navrženy pomocí výpočetní studie. Dalším cílem bylo vyvinout rychlou a jednoduchou syntézu fluorescenčně značených derivátů aza dibenzocyclooctynu na pevné fázi. Klíčová tvorba trojné vazby na cyclootynovém systému nebyla bohužel i přes řadu optimalizací úspěšná. Nicméně, připravené prekurzory nesoucí dvojnou vazbu mohou být použity pro konjugační reakce využívající alkeny. Druhým typem studovaných sloučenin byly deriváty cycloalka-1,2,3-selenadiazolů, které se mohou působením vysokých teplot nebo UV záření rozkládat za vzniku cykloalkynů podléhajícím konjugačním reakcím s azidy. První část práce byla zaměřena na studium mikrovlnami a fotochemicky iniciovaných konjugačních reakcí cyklookta[d][1,2,3]selenadiazolu s různými azidy. Obě metody poskytují požadované 1,2,3 triazoly. Aplikace fotochemicky iniciované reakce byla demonstrována na konjugační reakci cyklookta[d][1,2,3]selenadiazolu s komplexem avidin-modifikovaný biotin. Dále byly připraveny deriváty cyklookta[d][1,2,3]selenadiazolu nesoucí substituenty s různými elektronovými vlastnostmi s cílem snížit teplotu potřebnou pro konjugační reakci. Bohužel, oba typy připravených derivátů vykazovaly při reakci s azidy mnohem nižší reaktivitu než nesubstituovaný cyklookta[d][1,2,3]selenadiazol. Poslední část pak byla zaměřena na přípravu dibenzothiepino- a dibenzoselenepino-1,2,3-selenadiazolů s cílem zvýšit reaktivitu u fotochemicky iniciovaných konjugačních reakcí. Všechny připravené 1,2,3-selenadiazoly poskytovaly různé produkty v závislosti na typu 1,2,3-selenadiazolu a na použité vlnové délce. Non-catalyzed click reactions are widely used in range of biological applications. Although a number of derivatives of cyclic alkynes have been developed till now for these purposes, the most of these systems suffer from complicated and multi-step synthesis with low overall yields which limits their wider use. Often insufficient characterization of products formed by conjugation reaction of these alkynes with azides is another important problem in this field. The presented thesis was focused on preparation of two types of compounds for non catalyzed conjugation reaction with azides. Firstly, conjugation reactions of known aza dibenzocyclooctyne with azides derived from 5-methyluridine were studied. Synthesized products were characterized by detail NMR study, which showed presence of conformational isomers at all prepared compounds. The computational study then helped to suggest the cause of occurrence and structure of these isomers. Then, the attention was paid to development of fast and simple procedure for fluorescently labelled derivatives of aza-dibenzocyclooctyne on solid phase. Unfortunately, the key formation of triple bond on cyclooctyne system has not been successful despite a number of optimizations. However, prepared precursors having double bond can be used for conjugation reactions using alkenes. Derivatives of cycloalka-1,2,3-selenadiazoles were the second type of studied compounds. Cycloalka-1,2,3-selenadiazoles can decompose by high temperatures or UV irradiation to cycloalkynes undergoing the conjugation reactions with azides. The first part of work was focused on study of microwave assisted and photochemically initiated conjugation reactions of cycloocta[d][1,2,3]selenadiazole with structurally different azides. The both method resulted in target 1,2,3-triazoles. The potential application of photochemically initiated reaction was then successfully demonstrated on conjugation reaction of cycloocta[d][1,2,3]selenadiazole derivative with avidin-modified biotin complex. Then, derivatives of cycloocta[d][1,2,3]selenadiazole bearing substituent with different electronic properties were prepared to decrease the temperature necessary for conjugation reaction. Unfortunately, both type of synthesized derivatives exhibited much lower reactivity during reaction with azides than unsubstituted cycloocta[d][1,2,3]selenadiazole. In the last part, the attention was paid to preparation of dibenzothiepine- a dibenzoselenepine-1,2,3-selenadiazoles with the aim to enhance the reactivity at photochemically initiated conjugation reactions. All synthesized 1,2,3-selenadiazoles provided different products depending on 1,2,3-selenadiazole structure and used wavelength. Keywords: Azid-alkyn cykloadice; nekatalyzovaná konjugační raekce; azadibenzocyklooktyn; 1;2;3-selenadiazol; Azide-alkyne cycloaddition; non-catalyzed conjugation reaction; azadibenzocyclooctyne; 1;2;3-selenadiazole Available in digital repository of UPOL. Studium nových systémů pro nekatalyzované konjugační reakce s azidy

Nekatalyzované konjugační reakce alkynů s azidy jsou široce používané v řadě biologických aplikací. Ačkoliv byla vyvinuta řada derivátů cyklických alkynů pro tyto účely, jejich komplikovaná a ...

JEDINÁKOVÁ, Petra; HLAVÁČ, Jan; HLAVÁČ, Jan
Univerzita Palackého v Olomouci, 2017

NEW APPROACHES TO PHYTOHORMONE ANALYSIS IN PLANTS
ŠIMURA, Jan; NOVÁK, Ondřej; NOVÁK, Ondřej
2017 - English Disertační práce je zaměřena na vývoj analytických metod využívajících nástrojů cílené metabolomiky ke studiu rolí rostlinných hormonů (fytohormonů) při regulaci vývojových procesů u rostlin. Tato strukturně různorodá skupina aktivních látek hraje nezastupitelnou roli v komunikaci mezi rostlinnými buňkami, pletivy a orgány. Ukazuje se, že různé hormonální signální dráhy jsou provázány a propojeny v jednotnou síť stimulů a odpovědí. Informace o hormonálních hladinách jsou často cenným a důležitým doplňkem molekulárně-biologického bádání a prohlubují naše znalosti o jejich účinku. Fytohormony se v rostlinách nacházejí v nízkých koncentracích (10-10 10-15 mol/g) a jejich studium vyžaduje kombinaci efektivního izolačního postupu a selektivní a citlivé analytické koncovky. Hlavním cílem práce je vyvinutí optimální extrakční, purifikační metody a následné separační a detekční metody využívající ultra vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii ve spojení s tandemovým hmotnostním spektrometrem (UHPLC-MS/MS) umožňující stanovení více než stovky látek (prekurzorů, biologicky aktivních látek a metabolitů) z rodin auxinů, cytokininů, giberelinů, brassinosteroidů, salicylové kyseliny, abscisové kyseliny a jasmonové kyseliny v jedné analýze. Pro SPE (extrakce na pevné fázi) byla vyvinuta a optimalizována metoda, založena na hydrofobních/hydrofilních vlastnostech analytů, která umožňuje efektivní odstranění rostlinných barviv z extraktu při zachování vysoké návratnosti cílových látek. Zároveň byla vyvinuta nová separační metoda (UHPLC) ve spojení s detekční metodou (MS/MS) s optimální separací cílových látek a jejich stanovení v MRM módu. SPE-UHPLC-MS/MS metoda byla validována na rostlinném materiálu Arabidopsis thaliana var. Columbia a poprvé využita pro cílené komplexní profilování hladin fytohormonů v koříncích a stoncích čtrnáctidenních A. thaliana po vystavení rostliny salinickému stresu po dobu 48 hodin. V další části práce byla vyvinuta miniaturizovaná metodika pro izolaci a stanovení tRNA-vázaných cytokininů, která byla použita u analýzy mechu Physcomitrella patens a dále také u různých mikrořas a sinic, u kterých bylo studováno jednak spektrum látek z rodiny cytokininů a taktéž poměrné zastoupení volných a tRNA vázaných cytokininů. Dalším předmětem studia bylo provázání výsledků z analýz fytohormonálního profilu metabolitů auxinů a cytokininů obsažených v jednotlivých segmentech stonků rychle rostoucích, bezkořenných, sladkovodních, masožravých rostlin Aldrovanda vesiculosa a Utricularia australis a jejich dormantního stádia (tzv. turionu), s již dříve popsanými fyziologickými aspekty jejich vývoje a životního cyklu (např. rychlý apikální růst, alokace nutrientů, fotosyntéza či senescence). Zde výsledky poukázaly jak na význam detailní analýzy látek z jedné rodiny fytohormonů, tak i na důležitost studia provázanosti různých fytohormonálních skupin a jejich analýzy v širším měřítku. Výsledky mé disertační práce přispívají k zavedení rutinních citlivých metod pro stanovení rostlinných hormonů, umožňujících sledování vzájemných interakcí těchto látek v rostlinách a ke studiu jejich metabolických drah. Dissertation thesis is mainly dedicated to the development of new analytical methods for plant hormone analysis utilizing targeted metabolomic approach and the application of these newly developed methods (and well-established ones) in plant hormone determination with a focus on signalling and crosstalk. Information about plant hormone levels are often valuable and important in studies concerned with plant growth and development and deepen our knowledge about their occurrence and function. The characteristic of all hormones is that they are typically found in tissues in minute concentrations (10-10 10-15 mol/g). Thus, direct quantification in complex plant extracts requires a combination of effective isolation protocol and selective and sensitive analytical instrument. The primary objective of this thesis was development of analytical protocol including sample preparation (extraction and purification) and a method based on ultra-high performance liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) for complex phytohormone analysis. Combined, providing a tool for simultaneous determination of more than 100 compounds (precursors, active compounds, and metabolites) from auxin, cytokinin, gibberellin, brassinosteroid, jasmonic acid, abscisic acid, and salicylic acid families. Solid phase extraction (SPE) based on hydrophilic-hydrophobic interactions was used for effective removal of plant pigments while maintaining high recovery of the targeted compounds. UHPLC was used for optimal separation of targeted compounds and tandem mass spectrometry utilizing multiple reaction monitoring (MRM) was used for their precise determination. The SPE-UHPLC-MS/MS method was validated on material from Arabidopsis thaliana var. Columbia and first used for complex targeted plant hormone profiling in roots and shoots of 14 days old A. thaliana seedlings exposed to salt stress for last 48 hours prior harvest. Furthermore, a miniaturized method for tRNA bound cytokinin extraction was developed, and used for determination of cytokinin content in Physcomitrella patens and algal and cyanobacteria species. Also, well established methods were used for cytokinin and auxin determination in segmented shoots of rootless aquatic carnivorous plants Aldrovanda vesiculosa and Utricularia australis and their dormant organs (turions). Results were furthermore discussed in conjunction with formerly described physiological aspects of these plants' life cycle (e.g. rapid apical growth, nutrient allocation, photosynthesis, or senescence). Herein, findings pointed out the importance of detailed screening of compounds from one phytohormone family as well as the importance of plant hormone profiling in wider context. Results from this dissertation thesis contribute to the introduction of routine, sensitive methods for the determination of plant hormones allowing monitoring the interactions of these substances (crosstalk) and to study their metabolic pathways. Keywords: Rostlinné hormony; Extrakce na pevné fázi (SPE); Ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie (UHPLC); tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS); Plant hormones; Solid-phase extraction (SPE); Ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC); Tandem mass spectrometry (MS/MS) Available in digital repository of UPOL. NEW APPROACHES TO PHYTOHORMONE ANALYSIS IN PLANTS

Disertační práce je zaměřena na vývoj analytických metod využívajících nástrojů cílené metabolomiky ke studiu rolí rostlinných hormonů (fytohormonů) při regulaci vývojových procesů u rostlin. Tato ...

ŠIMURA, Jan; NOVÁK, Ondřej; NOVÁK, Ondřej
Univerzita Palackého v Olomouci, 2017

Aplikace kvantitativní obrazové analýzy pro studium buněčné odpovědi na DNA poškození
VESELÁ, Eva; HODNÝ, Zdeněk; BEKKER-JENSEN, Simon; MISTRÍK, Martin
2017 - English Soubor komplexních signálních drah zajišťující rozpoznání, signalizaci a opravu DNA poškození se souhrnně nazývá odpověď na DNA poškození. Tyto dráhy jsou nezbytné pro udržování stability genomu. Narušení těchto drah přispívá k mutagenezi, karcinogenezi, apoptóze a senescenci. V předkládané práci byla v živých buňkách měřena dynamika odpovědi na lokalizované DNA poškození tří proteinů: MDC1, 53BP1 a FANCD2. Lokalizované DNA poškození, tzv. laserová mikroiradiace (LMI), bylo indukováno pomocí laserového skenovacího mikroskopu. V práci je představen nový způsob iradiace vzorků, který má několik výhod oproti běžně používaným technikám LMI: DNA poškození je generováno rychleji a má pravidelnou strukturu souběžných pruhů, která umožňuje vyhodnocení pomocí automatizované obrazové analýzy. Metodu je možné využít také pro další foto-manipulační techniku FRAP a pro imunofluorescenční detekci markerů DNA poškození. Metoda umožňuje jednoduché a objektivní vyhodnocení dostatečného počtu vzorků pro robustní statistickou analýzu a představuje tak značné usnadnění využití laserové skenovací mikroskopie pro high-content screening. V druhé části této práce byla převážně pomocí kvantitativní obrazové analýzy studována role XPC proteinu v odpovědi na replikační stres. Bylo vybráno několik specifických markerů účastnících se odpovědi tento typ DNA poškození a jejich lokalizace do míst poškození byla vyhodnocena ve vybraných fázích buněčného cyklu. Výsledky ukazují, že XPC protein by mohl hrát roli v raných fázích odpovědi na DNA poškození. XPC pravděpodobně usnadňuje vazbu dalších proteinů, čímž přispívá ke správné a dostatečné aktivaci signálních drah aktivovaných DNA poškozením. DNA damage response (DDR) is a complex signalling network important for maintenance of DNA stability. Disrupted DDR was proposed to contribute to mutagenesis, carcinogenesis, induction of apoptosis and senescence. Here, the dynamics of DDR proteins, MDC1, 53BP1 and FANCD2 are evaluated in live cells in response to localised DNA damage generated by laser micro-irradiation (LMI). A new approach of LMI performed on laser scanning microscope was tested and software for automated quantitative image analysis was developed. The method presented here possess several advantages compared to commonly used approaches to LMI: it is faster and the DNA damage is induced in a regular pattern of collinear stripes that enabled development of automated quantitative image analysis software routine. The method was tested to be usable also for other photo-manipulation technique called fluorescence recovery after photo-bleaching (FRAP), and for immunofluorescent detection of DDR markers. The method provides an easy and unbiased evaluation of sufficient numbers of cells for robust statistical analysis and facilitates the use of LSM techniques for high-content screening. In the second part of the thesis, image analysis was used to elucidate the role of XPC protein in cellular response to replication stress (RS). Several markers of DDR were evaluated in particular phases of the cell cycle. XPC was suggested to be involved in early stages of cellular response to RS. XPC may facilitate recruitment of particular DDR proteins and thus contribute to successful DDR signalling. Keywords: rozpoznání DNA poškození; oprava DNA poškození; lokalizované ozáření laserem; obrazová analýza; mikroskopie; reportérové buněčné linie; XPC; HCS; rakovina; DNA damage recognition; DNA damage repair; laser micro-irradiation; image analysis; microscopy; reporter cell lines; XPC; HCS; cancer Available in digital repository of UPOL. Aplikace kvantitativní obrazové analýzy pro studium buněčné odpovědi na DNA poškození

Soubor komplexních signálních drah zajišťující rozpoznání, signalizaci a opravu DNA poškození se souhrnně nazývá odpověď na DNA poškození. Tyto dráhy jsou nezbytné pro udržování stability genomu. ...

VESELÁ, Eva; HODNÝ, Zdeněk; BEKKER-JENSEN, Simon; MISTRÍK, Martin
Univerzita Palackého v Olomouci, 2017