No (6893)
Number of found documents:
6893
Published from
to
Rozklad materiálu ve spektrální submikronové počítačové tomografii
Mikuláček, Pavel; Zikmund, Tomáš; Štarha, Pavel
2023 - English
Počítačová tomografie je nedestruktivní zobrazovací metoda vnitřních struktur vzorků. Využití nachází především v lékařství, ale také v průmyslu nebo výzkumu. V lékařství se také běžně používá spektrální počítačová tomografie, která umožňuje diferenciaci materiálů na základě jejich útlumových vlastností, které jsou závislé na energii rentgenového záření. Tento přístup se začíná také objevovat v průmyslových aplikacích. Tato práce se zabývá dvouenergetickou počítačovou tomografií, což je specifická forma spektrální tomografie využívající dvě různá rentgenová spektra. Dekompozici materiálu lze provádět buď na projekčních datech nebo na jejich rekonstrukcích. Výstupem jsou obrazy obsahující informace o koncetracích jednotlivých materiálů, které se nachází ve skenovaném objemu. Kromě koncetrací lze také zjistit atomová čísla a hustoty těchto materiálů. V této práci byla implementována základní metoda, jejíž výstupy slouží jako počáteční odhady v řadě iteračních algoritmů, které provádí dekompozici. Také byla provedena implementace metody, která redukuje šum v rozložených obrazech, jejichž hodnoty jsou vysoce korelované. Algoritmy byly testovány na umělých datech, ale také na reálných datech pořízených přístrojem Rigaku Nano3DX. Bylo provedeno srovnání vlivu různých tomografických artefaktů na výsledný rozklad materiálu Computed tomography is a non-destructive method for imaging internal structures of samples. It is mainly used in medicine, but also in industry or scientific fields. Spectral computed tomography is also commonly used in medicine, which allows the differentiation of materials based on their attenuation properties, which are dependent on the energy of the X-rays. This approach is also beginning to appear in industrial applications. This thesis deals with dual-energy computed tomography, which is a specific form of spectral tomography using two different X-ray spectra. Material differentiation, or decomposition, can be performed either on projection data or on their reconstructions. The output are images containing information about the concentrations of individual materials found in the scanned volume. In addition to the concentrations, the atomic numbers and densities of these materials can also be determined. In this thesis, a basic method of material decomposition was implemented, the outputs of which serve as initial guesses in a series of iterative algorithms that perform the decomposition. A method has also been implemented that reduces noise in decomposed images whose values are highly correlated. The algorithms were tested on artificial data, but also on real data scanned by the Rigaku Nano3DX device. A comparison of the effect of various tomographic artifacts on the resulting material decomposition was made.
Keywords:
tomographic reconstruction; dual-energy computed tomography; material decomposition; material concentration; tomografická rekonstrukce; dvouenergetická počítačová tomografie; dekompozice materiálu; koncentrace materiálu
Available in a digital repository NRGL
Rozklad materiálu ve spektrální submikronové počítačové tomografii
Počítačová tomografie je nedestruktivní zobrazovací metoda vnitřních struktur vzorků. Využití nachází především v lékařství, ale také v průmyslu nebo výzkumu. V lékařství se také běžně používá ...
Vývoj a výroba grafenových Hallových sond
Supalová, Linda; Červenka, Jiří; Bartošík, Miroslav
2023 - English
Pokrok v inženýrství a technologiích vytvořil zájem o stabilní detektory magnetického pole schopné operovat v širokém rozsahu teplot. Senzory založené na Hallově jevu a obří magnetorezistenci jsou nejčastěji využívaná zařízení k neinvazivnímu měření statických i dynamických magnetických polí v reálném čase. Aplikace zařízení na bázi Hallova jevu zahrnují například lineární senzory magnetického pole, gyrátory, rychlostní a směrové senzory, elektrické kompasy a senzory proudu, v oblastech sahajících od výroby, automobilového a kosmického průmyslu po komunikační systémy. Nicméně současné materiály využívané v Hallových sondách (především III-V polovodiče jako InSb nebo GaAs) mají potíže s teplotní stabilitou. V této práci se zabýváme výrobou Hallových sond založených na grafénu a jejich testováním za zvýšených teplot. Úspěšně jsme vyrobili grafénové Hallovy sondy v uspořádání polem řízeného tranzistoru pomocí standartních výrobních metod jako litografie a depozice tenkých vrstev. Volba uspořádání polem řízeného tranzistoru nám umožňuje naplno využít vynikajících elektrických vlastností grafénu při testování těchto Hallových sond v rozmezí od pokojové teploty až do 200°C. Naše výsledky ukazují, že zvyšování teploty nezpůsobuje zásadní zhoršení výkonnosti grafénových Hallových sond i při teplotách nad 150°C. Tato práce otevírá dveře pro další výzkum chování grafénových Hallových sond za zvýšené teploty s důrazem na porozumění externích faktorů, které ovlivňují výkonnost takového senzoru při využití v normálních podmínkách. Advances in engineering and technology have created a demand for stable magnetic field detectors that are able to operate over a wide range of temperatures. At present, sensors based on the Hall effect and giant magnetoresistance effect are the most commonly used devices for real-time non-invasive measurement of both static and dynamic magnetic fields. Example applications of Hall effect-based devices include linear magnetic field sensors, gyrators, speed and directional sensors, electrical compasses, and current sensors, in areas ranging from manufacturing, automotive and aerospace to communication systems. However, currently used materials in Hall probes (mainly III-V semiconductors such as InSb or GaAs) struggle with temperature stability. In this study, we address the fabrication of Hall probes based on graphene and their testing at elevated temperatures. We successfully produce graphene Hall probes in a field effect transistor (FET) arrangement using standard fabrication techniques such as lithography and thin layer deposition. The choice of \acs{FET} architecture allows us to take full advantage of the outstanding electronic properties of graphene during testing of the Hall probes from room temperature up to 200°C. Our results reveal that increasing temperature does not cause significant degradation in the performance of graphene Hall probes even at temperatures above 150°C. This work paves the way for future investigations into the behaviour of graphene Hall probes at elevated temperatures, focusing on understanding the external factors that influence and impact the performance of the sensor in ambient conditions.
Keywords:
graphene; Hall probe; Hall effect; field effect transistor; lithography; gafén; Hallova sonda; Hallův jev; polem řízený tranzistor; litografie
Available in a digital repository NRGL
Vývoj a výroba grafenových Hallových sond
Pokrok v inženýrství a technologiích vytvořil zájem o stabilní detektory magnetického pole schopné operovat v širokém rozsahu teplot. Senzory založené na Hallově jevu a obří magnetorezistenci jsou ...
Boundary effects in signal processing: From classical problems to new opportunities
Popoola, Seyi James; Druckmüllerová, Hana; Cicone, Antonio
2023 - English
Tato práce se zaměřuje na hraniční problémy při rozkladu signálů. Problematika hranic klasických metod byla rozsáhle studována, ale v posledních několika desetiletích byla představena nová generace metod. Implementace těchto nových metod má potenciál produkovat efektivním způsobem přesnější, flexibilnější a interpretovatelné výsledky, které mohou pomoci posunout výzkum v reálných aplikacích v různých oblastech. Hraniční problémy pro tyto techniky byly studovány teprve nedávno. Dosud zveřejněné výsledky ukazují, že tyto metody mají svá omezení a předpoklady, které je třeba pečlivě zvážit, aby se předešlo možnému zneužití. V této studii identifikujeme a řešíme hlavní překážky spojené s používáním těchto nových metod a poskytujeme také doporučení, jak je co nejefektivněji využít. Abychom dále ilustrovali možné důsledky nesprávného použití, provádíme komplexní zkoumání jejich aplikace na skutečná data a provádíme numerické simulace. Nakonec navrhujeme soubor osvědčených postupů pro optimalizaci výkonu těchto technik v kontextu rozkladu signálu. Zásadním návrhem je použít před aplikací jakékoli metody rozkladu techniku rozšíření signálu jako prostředek ke zmírnění hraničních efektů. This thesis focuses on boundary issues in the decomposition of signals. Classical methods boundary issues have been studied extensively, but a new generation of methods has been introduced in the last couple of decades. The implementation of these novel methods has the potential to produce in an efficient way more accurate, flexible, and interpretable results, which can help advance research in real-life applications in various fields. Boundary issues for these techniques have been studied only recently. The results published so far shows that these methods have limitations and assumptions that need to be carefully considered to avoid potential misuse. In this study, we pinpoint and tackle the major obstacles associated with the use these new methods, and the recommendations on how to utilize them most effectively is also provided. To further illustrate the potential consequences of improper usage, we undertake a comprehensive examination of their application to actual data and carry out numerical simulations. Lastly, we propose a set of best practices for optimizing the performance of these techniques in the context of signal decomposition. A crucial suggestion is to employ, before applying any decomposition method, a signal extension technique as a means of mitigating boundary effects.
Keywords:
Signal Processing; Electrocardiogram; Signal Amplitude; Signal Frequency; Periodic Signal; Time Period; Analog Signal; Digital Signal; Aperiodic Signal; Linear Time Invariant System; Discrete Time; Continuous Time; Even Signal; Continuous-Time Even Signal; Sinusoidal Signal; Continuous Time Sinusoidal signal; Stationary Signal; Non-Stationary Signal; Fourier Series (FS); Fourier Transform (FT); Continuous Fourier Transform; Discrete Fourier Transform (DFT); Discrete Time Fourier Transform; Fast Fourier Transform (FFT); Continuous Time Fourier Transform; Continuous Time; Short-Time Fourier Transform; Overlap-Add Method; Wavelet Transform; Empirical Mode of Decomposition (EMD); Iterative Filtering (IF); Intrinsic Mode Functions (IMF).; Signal Processing; Electrocardiogram; Signal Amplitude; Signal Frequency; Periodic Signal; Time Period; Analog Signal; Digital Signal; Aperiodic Signal; Linear Time Invariant System; Discrete Time; Continuous Time; Even Signal; Continuous-Time Even Signal; Sinusoidal Signal; Continuous Time Sinusoidal signal; Stationary Signal; Non-Stationary Signal; Fourier Series (FS); Fourier Transform (FT); Continuous Fourier Transform; Discrete Fourier Transform Zpracování signálu; Elektrokardiogram; Amplituda signálu; Frekvence signálu; Periodický signál; Časová perioda; Analogový signál; Digitální signál; Aperiodický signál; Lineární časově invariantní systém; Diskrétní čas; Kontinuální čas; Sudý signál; Se spojitým časem Sudý signál; Sinusový signál; Spojitý Časově sinusový signál; stacionární signál; nestacionární signál; Fourierova řada (FS); Fourierova transformace (FT); spojitá Fourierova transformace; diskrétní Fourierova transformace (DFT); Fourierova transformace s diskrétním časem; rychlá Fourierova transformace (FFT); spojitá Fourierova transformace Transformace; spojitý čas; krátkodobá Fourierova transformace; metoda sčítání překrytí; vlnková transformace; empirický způsob rozkladu (EMD); iterativní filtrování (IF); funkce vnitřního režimu (IMF).
Available in a digital repository NRGL
Boundary effects in signal processing: From classical problems to new opportunities
Tato práce se zaměřuje na hraniční problémy při rozkladu signálů. Problematika hranic klasických metod byla rozsáhle studována, ale v posledních několika desetiletích byla představena nová generace ...
Návrh měření a optimalizace vodivých vrstev hřbetního krytu letounu L-39NG z uhlíkového kompozitu
Pham, Ngoc Nam; Hönig,, Martin; Háze, Jiří
2023 - English
V posledních desetiletích je v leteckém průmyslu výrazně preferováno použití kompozitů. Nejnovější projekty českého leteckého průmyslu se zaměřují také na zvýšení využití kompozitů v nových letadlech. Tato práce se zaměřuje na výzkum elektrických vlastností kompozitu za účelem optimalizace výběru materiálu. Diplomová práce představuje návrh automatické měřicí stanice sloužící k měření a testování elektrických vlastností kompozitních vzorků vyráběných společností AERO Vodochody AEROSPACE as. K tomuto účelu je použito zařízení LCR bridge R&S HM8118 a řídicí program je navržen v prostředí MATLAB s použitím jazyka SCPI. Navržený systém je následně použit pro experimentální ověření elektrické vodivosti kompozitních vzorků. Výsledky měření budou základem pro vývoj kompozitů pro leteckou vodivost v nových letadlech. Tato práce také prezentuje výsledky testu úderu blesku na vybraných kompozitních vzorcích. Výsledky testu na úder blesku poskytují hlubší znalosti o schopnosti vzorků chránit před úderem blesku. V této práci je také představen vývoj nedestruktivního testovacího systému založeného na metodě elektrické impedance/odporové tomografie. Vývoj je v prvních fázích, ale očekává se, že systém bude využíván jako systém monitorování zdraví struktur. In recent decades, the use of composites has been dramatically preferred in the aerospace industry. The latest projects of the Czech aviation industry also focus on increasing the use of composites in new aircraft. This thesis focusses on the research of the electrical properties of the composite in order to optimize the choice of material. The thesis presents the design of an automatic measuring station used for measuring and testing the electrical properties of composite specimens produced by the company AERO Vodochody AEROSPACE a.s. For this purpose, the device LCR bridge R&S HM8118 is used, and the control program is designed in the MATLAB environment by using the SCPI language. The proposed system is then used for experimental verification of the electrical conductivity of composite samples. The measurement results will be the basis for the development of aviation conductivity composites in new aircraft. This thesis also presents the results of the lightning strike test on the selected composite specimens. Results of the lightning strike test provide deeper knowledge about the lightning strike protection ability of specimens. The development of a Non-destructive testing system based on the method of Electrical Impedance/Resistance Tomography is also presented in this thesis. The development is in the first stages, but the system is expected to be used as a structural health monitoring system.
Keywords:
Composite materials; AERO Vodochody AEROSPACE a.s.; SCPI; MATLAB; L-39NG; Lightning strike test; FPGA; Non-destructive testing; Electrical impedance tomography; Kompozitní materiály; AERO Vodochody AEROSPACE a.s; SCPI; MATLAB; L-39NG; Test úderu bleskem; FPGA; Nedestruktivní testování; Elektrická impedanční tomografie
Available in a digital repository NRGL
Návrh měření a optimalizace vodivých vrstev hřbetního krytu letounu L-39NG z uhlíkového kompozitu
V posledních desetiletích je v leteckém průmyslu výrazně preferováno použití kompozitů. Nejnovější projekty českého leteckého průmyslu se zaměřují také na zvýšení využití kompozitů v nových letadlech. ...
Výukový nanosatelit formátu PocketQube
Lokaj, Jakub; Zamazal, Michal; Povalač, Aleš
2023 - English
Hlavním tématem této diplomové práce byla teoretická analýza současných trendů ve vývoji nanosatelitů, konkrétně se zaměřením na formát PocketQube a jeho aktuální implementaci. V jednotlivých teoretických kapitolách se práce zabývá možnostmi a výhodami využití PocketQube jako výukového modelu pro vzdělávací a vývojové oblasti. Zabývá se také možnostmi 3D tisku nosné konstrukce družice a rozebírám jednotlivé komponenty, jako je palubní počítač, komunikační systém založený na technologii LoRa, napájecí systém a přehled subsystémů. V praktické části byl vyvinut rám družice, jednotlivé části struktury elektroniky PocketQube a implementace základní funkce komunikace a provozu pro vzdělávací model PocketQube. The main topic of this diploma thesis was the theoretical analysis of current trends in the development of nanosatellites, specifically focusing on the PocketQube format and its actual implementation. In the individual theoretical chapters, it is discussed the possibilities and advantages of using PocketQube as a learning model for educational and developmental fields. There are explored 3D printing options for the supporting structure of the satellite and discuss individual components such as the on-board computer, communication system based on LoRa, power system, and an overview of subsystems. In the practical part, there were developed the frame of the satellite, individual parts of the PocketQube electronics structure, and implemented the basic functionality of communication and operation for the educational PocketQube model.
Keywords:
Pocket Qube; LoRa communication; STM32; 3D print; EPS; OBC; Pocket Qube; komunikace LoRa; STM32; 3D tisk; EPS; OBC
Available in a digital repository NRGL
Výukový nanosatelit formátu PocketQube
Hlavním tématem této diplomové práce byla teoretická analýza současných trendů ve vývoji nanosatelitů, konkrétně se zaměřením na formát PocketQube a jeho aktuální implementaci. V jednotlivých ...
Predikce sekundární struktury RNA
Polzerová, Nikola; Schwarzerová, Jana; Jurečková, Kateřina
2023 - English
Sekundární struktura RNA se stala v posledních letech fenoménem. Hraje klíčovou roli v pochopení principů genové exprese a stability RNA, a také pokládá důležitý základ pro správnou predikci terciálních struktur. Proto dochází k velice rychlému rozvoji predikce pomocí výpočetních metod a také pomocí metod strojového učení. V rámci práce byly popsány nejčastěji citované metody strojového učení pro predikci sekundárních struktur RNA. Na základě získaných znalostí byla implementována reziduální neuronová síť. Implementovaná reziduální síť byla netrénována, validována a otestována na sekvencích z datasetu bpRNA-1m, jejichž sekundární struktury neobsahují pseudouzly. RNA secondary structure has become a phenomenon in last years. It plays a key role in understanding the principles of gene expression and RNA stability. It also plays an important foundation for correct prediction of tertiary structures. That resulted into rapid development of secondary structure prediction throughout computational methods and especially machine learning methods. The most frequently cited machine learning methods for RNA secondary structure prediction were described. Based on gained knowledge, a residual network was implemented. Implemented residual network was trained, validated and tested on pseudoknotted free structures from bpRNA-1m dataset.
Keywords:
RNA secondary structure; secondary structure elements; machine learning; deep learning; neural network; residual neural network; sekundární struktura RNA; elementy sekundární struktury; strojové učení; hluboké učení; neuronové sítě; reziduální neuronová síť
Available in a digital repository NRGL
Predikce sekundární struktury RNA
Sekundární struktura RNA se stala v posledních letech fenoménem. Hraje klíčovou roli v pochopení principů genové exprese a stability RNA, a také pokládá důležitý základ pro správnou predikci ...
Bezpečný přenos elektronické pošty
Horký, Matyáš; Juráň, Radovan; Tomašov, Adrián
2023 - English
Diplomová práce zkoumá alternativní přístup k e-mailu. Ten, i když je nejběžnější a univerzální způsob komunikace přes internet s téměř kýmkoliv online, ať jde o soukromou osobu nebo organizaci, trpí technickými i praktickými problémy, jakými jsou například absence soukromí nebo spolehlivosti. Práce hodnotí ekosystém e-mailu, spolu s aktuálním stavem kryptografie, a navrhuje nový protokol a datový formát který by mohl být použit téměř transparentně. Protokol je postavený nad mTLS a PKI; definuje konkrétní zprávy které mohou být použity k dohodnutí přenosu dat mezi klienty a servery. Datový formát je vlastní lineárně čitelný binární formát, strukturovaný způsobem hlavička–délka–data. Výsledek je vyhodnocen jeho přínosy a nevýhodami, spolu s obecným zamyšlením o důležitosti a místu e-mailu v současném internetu. The Master thesis examines alternative approaches to e-mail. While it is the most common and universal approach to communicate with nearly anyone online, be it a person or an organization, it suffers from both technical and practical insufficiencies like the lack of reliability and privacy. The thesis evaluates the e-mail ecosystem and the current state of cryptography. It proposes a new protocol and file format that could replace the e-mail nearly transparently. The protocol is built on mTLS and PKI; it defines specific messages that can be used to negotiate data transfer between clients and servers. The file format is a linearly parseable custom binary format structured in a header–length–data manner. The result is evaluated on new ideas and new drawbacks, along with general thoughts about e-mail’s place on today’s internet.
Keywords:
binary format; digital messages; e-mail; mTLS; secure protocol; bezpečný protokol; binární formát; digitální zprávy; e-mail; mTLS
Available in a digital repository NRGL
Bezpečný přenos elektronické pošty
Diplomová práce zkoumá alternativní přístup k e-mailu. Ten, i když je nejběžnější a univerzální způsob komunikace přes internet s téměř kýmkoliv online, ať jde o soukromou osobu nebo organizaci, trpí ...
Bydlení u řeky
Malahefji, Tarek; Kubínová, Šárka; Wittmann, Maxmilian
2023 - English
The city of Brno is the capital of Moravia in the Czech Republic which was shaped by many historical events, its predominant textile industry was amongst the most important aspects of these criteria, since its main rivers cut through the city (Svratka, Svitava), this industry and its trade, was a main factor in shaping the city as a whole, alongside political conflicts, change of regimes. During the 1960s, after the planned style economy was settled completely, it resulted in big setbacks for the Czechoslovak economy, as the textile industry started to crumble. The final blow to this industry happened after the velvet revolution as privatization took place and most remaining factories were dismantled. This narrative had a big role in shaping how Brno looks today as the northern part of the city is more urbanized than the southern part which is more industrialized by nature, and unlike Prague, these two main rivers are not widely crucial to the public life. This also developed along with other factors a major problem with accommodation quality, price as official data reports increasing dissatisfaction from inhabitants with housing. The city of Brno is the capital of Moravia in the Czech Republic which was shaped by many historical events, its predominant textile industry was amongst the most important aspects of these criteria, since its main rivers cut through the city (Svratka, Svitava), this industry and its trade, was a main factor in shaping the city as a whole, alongside political conflicts, change of regimes. During the 1960s, after the planned style economy was settled completely, it resulted in big setbacks for the Czechoslovak economy, as the textile industry started to crumble. The final blow to this industry happened after the velvet revolution as privatization took place and most remaining factories were dismantled. This narrative had a big role in shaping how Brno looks today as the northern part of the city is more urbanized than the southern part which is more industrialized by nature, and unlike Prague, these two main rivers are not widely crucial to the public life. This also developed along with other factors a major problem with accommodation quality, price as official data reports increasing dissatisfaction from inhabitants with housing.
Keywords:
sustainability; urban design; recycling; co2 emissions; river; structure; pedestrian; social housing; socializing; sustainability; urban design; recycling; co2 emissions; river; structure; pedestrian; social housing; socializing
Available in a digital repository NRGL
Bydlení u řeky
The city of Brno is the capital of Moravia in the Czech Republic which was shaped by many historical events, its predominant textile industry was amongst the most important aspects of these criteria, ...
Ghost Cities of Estonia
Akindinov, Nikita; Čunát, Matěj; Dokoupilová Pazderková, Kateřina
2023 - English
The study on the topic of the ghost cities of Estonia draws a sad picture of certain mining and industrial settlements. The first chapter of the project includes historical and theoretical research about the ghost effect in places which were filled with mono functions. Before the USSR collapse economical and social chains of these communes were integrated in the system of the very close relationships with its center. At the same time there were no proposed long-term strategies on how cities can work and survive after the resource depletion. It brought towns and villages like Viivikonna to the point where the skeleton of the settlement still exists but its population is close to zero. Additionally this problem continued with the wave of the outflow of young people to large cities. The second and main chapter was to choose one of the ghost villages which still has some inhabitants. It was important to understand how we can make these places more livable for them and how it can work with the new points of attraction. In some aspects it could bring fresh public and financial interest to the area and open new work places for locals. Analyzing some examples of the different spots around Europe, there were determined certain healing tools which helped to warm up the interest among visitors at these areas. As a major thing for the reboot process there was chosen a cultural function. With the five steps program there was proposed a way how we can rebuild this area and involve it in the new processes with neighboring cities. The study on the topic of the ghost cities of Estonia draws a sad picture of certain mining and industrial settlements. The first chapter of the project includes historical and theoretical research about the ghost effect in places which were filled with mono functions. Before the USSR collapse economical and social chains of these communes were integrated in the system of the very close relationships with its center. At the same time there were no proposed long-term strategies on how cities can work and survive after the resource depletion. It brought towns and villages like Viivikonna to the point where the skeleton of the settlement still exists but its population is close to zero. Additionally this problem continued with the wave of the outflow of young people to large cities. The second and main chapter was to choose one of the ghost villages which still has some inhabitants. It was important to understand how we can make these places more livable for them and how it can work with the new points of attraction. In some aspects it could bring fresh public and financial interest to the area and open new work places for locals. Analyzing some examples of the different spots around Europe, there were determined certain healing tools which helped to warm up the interest among visitors at these areas. As a major thing for the reboot process there was chosen a cultural function. With the five steps program there was proposed a way how we can rebuild this area and involve it in the new processes with neighboring cities.
Keywords:
Ghost towns; ghost cities; abandoned villages; abandoned settlements; mono-towns; monocities; Viivikonna; Estonia; Ghost towns; ghost cities; abandoned villages; abandoned settlements; mono-towns; monocities; Viivikonna; Estonia
Available in a digital repository NRGL
Ghost Cities of Estonia
The study on the topic of the ghost cities of Estonia draws a sad picture of certain mining and industrial settlements. The first chapter of the project includes historical and theoretical research ...
Využití fluorescenčních technik k analýze průmyslově významných mikroorganismů
Müllerová, Lucie; Kráčmar, Stanislav; Krčma, František; Obruča, Stanislav
2023 - English
Techniky analýzy jednotlivých buněk neboli single-cell analýzy, jsou velmi důležité v kontextu studia důležitých biotechnologických mikroorganismů. V biotechnologických procesech je optimální mít rychlé, efektivní a real-time analýzy, které lze provést s minimální přípravou vzorku. Proto jsme v rámci předložené disertační práce využili autofluorescenci jako marker fyziologického stavu mikrobiální kultury, který je možné analyzovat pomocí fluorescenční mikroskopie a/nebo průtokové cytometrie. Nejdříve bylo potvrzeno, na základně emisních spekter, že zelená autofluorescence emitovaná bakteriemi Cupriavidus necator H16 a jejím polyhydroxyalkanoáty (PHA) neprodukujícím mutantem Cupriavidus necator PHB-4, pochází skutečně z flavinů. Emisní maximum bylo naměřeno v rozmezí 510–550 nm pro FAD, FMN a riboflavin – bohužel jednotlivá spektra od sebe nebylo možné rozeznat, a 515 nm pro oba bakteriální kmeny Cupriavidus necator. Byly nalezeny dvě maxima excitačních spekter, jedno v rozmezí 360–370 nm a druhé okolo 440 nm. Z těchto poznatků byl sestaven nový protokol pro fluorescenční mikroskopii – laser byl nastaven na hodnotu 467 nm a emisní filtr pro detekci byl vybrán 520/35 nm. Flaviny a jejich autofluorescence může být take použita v kombinaci s jinými fluorofory, když jsou použity multiparametrické analýzy, ale je důrazně doporučeno, aby vybrané fluorescenční sondy buď emitovaly v jiném rozmezí, než je 500–550 nm anebo byla jejich doba života excitovaného stavu jiná, než je interval 3,2–3,7 a 4,2 – 4,9 ns. Tyto doby života navíc zůstaly konstantní, i když byly buňky vystaveny kultivačním a stresovým podmínkám. To z nich dělá velmi stabilní marker v porovnání s dynamickým charakterem intenzit fluorescence. Dále byl optimalizován protokol pro značení bakterie C. necator s využitím PHA specifické sondy BODIPY 493/503. Optimální koncentrace této lipofilní sondy byla stanovena na 2,5 µg ml-1 a sondu je možné dle našich dat aplikovat společně s viabilitní sondou propidium iodidem. Tento protokol byl také využit pro studium morfologie PHA-syntetizující halofilní bakterie Halomonas halophila. Pro stanovení UV-protektivních vlastností PHA obsaženého v bakterii Cupriavidus necator, byl optimalizován další protokol, tentokrát pro ROS citlivou sondu CM-H2DCFDA, která byla stanovená jako citlivější v porovnání s její nemethylovanou formou. V této studii byly navíc potvrzeny UV-protektivní vlastnosti PHA na bakterii Cupriavidus necator H16 v porovnání s PHA nesyntetizujícím kmenem Cupriavidus necator PHB-4. Single-cell analysis techniques are very important when studying relevant biotechnological microorganisms. In biotechnological processes, the optimum is to have fast, efficient and real-time analyses that can be done with minimal preparations. Therefore, we looked at autofluorescence as a possible and natural marker when employing fluorescence microscopy and flow cytometry. First, it has been established, based on the emission spectra, that the green autofluorescence of the bacteria used – Cupriavidus necator H16 and its non polyhydroxyalkanoates (PHA) producing mutant Cupriavidus necator PHB-4, is caused predominantly by flavins. The maxima of emission spectra were 510 – 550 nm for FAD, FMN and riboflavin whose spectra could not be distinguished, and 515 nm for both strains of Cupriavidus necator. Two maxima of excitation spectra of the bacteria were found – one in the range 360 – 370 nm and another around 440 nm, and so a new protocol for fluorescence microscopy has been established - the laser used was 467 nm and the emission filter chosen for the detection was 520/35 nm. Flavins and their autofluorescence can also be used in combination with other fluorophores when the need for multi-parametrical analyses arises, but it’s highly recommended the other dyes emit other than green fluorescence in the band of 500 – 550 nm or/and have an average fluorescence lifetime other than 3.2 – 3.7 and 4.2 - 4.9 ns. These values stayed constant even when the cells were exposed to various cultivation and even stress conditions. That makes them a very stable marker compared to the dynamic marker of fluorescence intensity that changes immediately after a change in the environment. A new staining protocol for C. necator using PHA-specific hydrophobic probe BODIPY 493/503 was optimised. The optimal staining concentration of the lipophilic dye BODIPY 493/503 was determined to be 2.5 µg ml-1 and it can be used in combination with propidium iodide. The BODIPY 493/503 staining protocol has been used when analysing the morphology of the PHA-synthesising bacteria Halomonas halophila. Further, to study the UV-protective properties of PHA in Cupriavidus necator, another staining essay has been optimised. It has been established that the ROS sensitive dye CM-H2DCFDA gives better performance than its non-methylated form. Also, the UV-protective characteristics of the PHA-synthesising strain Cupriavidus necator H16 were confirmed when compared to its non-PHA synthesising strain C. necator PHB-4.
Keywords:
Bacterial autofluorescence; Cupriavidus necator; Sporomusa ovata; Halomonas halophila; single cell analysis; average fluorescence lifetime; oxidative stress; ROS; biotechnological processes quality control; PHB protective characteristics; flow cytometry; fluorescence microscopy; fluorescence stain optimisation; Bakteriální autofluorescence; Cupriavidus necator; Sporomusa ovata; Halomonas halophila; analýzy jedné buňky; doba života excitovaného stavu; oxidativní stress; ROS; kvalita kontroly biotechnologických procesů; protektivní charakteristiky PHB; průtoková cytometrie; fluorescenční mikroskopie; optimalizace fluorescenčního barvení
Available in a digital repository NRGL
Využití fluorescenčních technik k analýze průmyslově významných mikroorganismů
Techniky analýzy jednotlivých buněk neboli single-cell analýzy, jsou velmi důležité v kontextu studia důležitých biotechnologických mikroorganismů. V biotechnologických procesech je optimální mít ...
NRGL provides central access to information on grey literature produced in the Czech Republic in the fields of science, research and education. You can find more information about grey literature and NRGL at service web
Send your suggestions and comments to nusl@techlib.cz
Provider
Other bases